wb檢測磷酸化蛋白 WB常見問題

wb檢測磷酸化蛋白 WB常見問題

wb常見問題

前言

是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。然而我們在做 WB 實驗時總會遇到各種各樣的問題,今天小艾為大傢整理瞭常見的 WB 實驗問題與處理方案。如有難題或者,歡迎聯系艾美捷科技服務團隊,或關註此微信公眾號!

1、 的優點

答:靈敏,可達 ng 級,用 Ecl 顯色法理論上可達 pg 級。方便,特異性高。

2、為什麼我的細胞提取液中沒有目標蛋白?

答:原因有很多:a)你的細胞中不表達這種蛋白質,換一種細胞;b)你的細胞中的蛋白質被降解掉瞭,你必需加入蛋白酶抑制劑 ,抑制蛋白酶活性;c)你的抗體不能識別目標蛋白,多看看說明,看是否有問題。

3、我的細胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,為什麼呢?

答:a)有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性完全,可以適當提高 SDS 濃度,同時將樣品煮沸時間延長,b)也不排除你的抗原濃度過高,這時再加入適量上樣緩沖液即可。

4、我做的蛋白質分子量很小(10KD),請問怎麼做 WB?

答:可以選擇 0.2μml 的膜,同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起,再轉移。其他按步驟即可。

wb檢測磷酸化蛋白_蛋白印跡試驗(wb)_小蛋白 wb

5、我的目的帶很弱,怎麼加強?

答:可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。

6、膠片背景很臟,有什麼解決方法?

答:減少抗原上樣量,降低一抗濃度,改變一抗孵育時間,提高牛奶濃度。

7、目標帶是空白,周圍有背景,是為什麼?

答:你的一抗濃度較高,二抗上 HRP 催化活力太強,同時你的顯色底物處於一個臨界點,反應時間不長,將周圍底物催化完,形成瞭空白即“反亮現象”。將一抗和二抗濃度降低,或更換新底物。

8、我的膠片是一片空白,是怎麼回事?

答:如果能夠排除下面的幾個問題那麼問題多半出現在一抗和抗原制備上。

a) 二抗的 HRP 活性太強,將底物消耗光;b)ECM 底物中 H2O2,不穩定,失活;c)ECL 底物沒覆蓋到相應位置;d)二抗失活。

wb檢測磷酸化蛋白_小蛋白 wb_蛋白印跡試驗(wb)

9、我在顯影液中顯影 1 分鐘和 5 分鐘後,底片漆黑一片,是什麼原因呢?

答:a)可能是紅燈造成的,膠片本來就被曝光瞭,可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.;b)顯影時間過長。

10、DAB 好還是 ECM 好?

答:DAB 有毒,但是比較靈敏,是 HRP 最敏感的底物;ECM 結果容易控制,但被催化時靈敏度差一點,但如果達到閥值,就特別靈敏,可以檢測 pg 級抗原。要看你實驗的情況。

11、抗原檢測出的分子量比資料上的大,是怎麼回事?

答:a)抗原形成瞭二聚體。增多巰基乙醇量,煮沸變性時間延長,可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,磷酸化等。

12、蛋白轉移不到膜上,但膠上有,同時 轉上去瞭,為什麼?

答:可能是:a)樣品濃度過低;b)轉移時間不夠。

13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加 NaF 等?

wb檢測磷酸化蛋白_小蛋白 wb_蛋白印跡試驗(wb)

答:NaF 是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般最好加。但是不加也可以,大部分時候是不用加的。

14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在,需要做免疫組化和 試驗嗎?做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎?

答:①免疫組化可以用來進行定位,但是不能精確定量,而且有時會有假陽性,不易與背景區分;可以特異性檢測某個蛋白質分子,進行定量,但是不能定位。②兩種實驗的一抗有時候不能通用,公司的產品說明一般都會說明可以進行什麼實驗,在免疫組化時,是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

15、做 時,提取蛋白後凍存(未加蛋白酶抑制劑),用的博士德的一抗,開始還有點痕跡,現在越來越差,上樣量已加到 120μg,換瞭個 的一抗仍不行。是什麼原因?蛋白酶抑制劑單加 PMSF行嗎?

答:懷疑是樣品問題,可能是:1,樣品不能反復凍融;2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時,建議檢查 過程,提高一抗濃度。對於加蛋白酶抑制劑來說,一般加 PMSF 就可以瞭,最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

16、細胞水平要做 ,多少細胞提的蛋白夠做 ?

答:一般 5×10^6 就足夠瞭。

17、同一樣品能同時提 RNA 又提蛋白麼?這樣對 有無影響?

答:能,沒有問題。

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18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的 檢測嗎?

答:當然可以,有的甚至可以同時測幾十種樣品。

19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要註意什麼?

答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑要溫和得多,這時最好加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性。

20、我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到 1 微克,但是在轉膜時經常會發現隻有一部分蛋白轉到瞭膜上,就是在轉膜後染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在,隻是顏色變淡瞭,有什麼辦法可以解決?

答:你可以加大上樣量,沒有問題,還有轉移時你可以用減少電流延長時間,加 20%甲醇。

21、想分離的蛋白是分子量 200kd 的,SDS-PAGE 電泳的分離膠濃度多大合適?積層膠的濃度又該用多少?這麼大分子量的蛋白容易作 嗎?

答:200kd 的蛋白不好做,分離膠用 7%,積層膠 3.5%。

22、如果上樣量超載,要用什麼方法來增加上樣量?

wb檢測磷酸化蛋白_小蛋白 wb_蛋白印跡試驗(wb)

答:可以濃縮樣品,也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載 30%是不會有問題的。如果已經超瞭不少瞭,而且小分子量的也要天才少女福爾摩斯,可以考慮加大膠的厚度,可以試試 1.5mm 的。

23、蛋白變性後可以存放多久?

答:-80℃,一兩年沒有問題。最關鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解瞭)。

24、我所測定的蛋白分子量是 105KD,按理說分離膠應當采用 7.5%,但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方,不知為何?

答:上述提到的兩種凝膠均可以使用,因為 105KD 的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內,但需註意條帶位置。

25、二抗是生物素化的抗體wb檢測磷酸化蛋白,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案後,封閉液是否

要作調整,能否再用 5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成,是嗎?

答:不能使用脫脂奶粉,因為脫脂奶粉中含生物素,用BSA代替應該好一點.

26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達量有關系嗎?

答: 一般上樣 30-100 微克不等,結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系,也與顯色時間長短有關。開始摸條件時,為瞭拿到陽性結果,各個步驟都可以量多一點時間長一點wb檢測磷酸化蛋白,當然背景也就出來瞭。要拿到好的結果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復地試瞭,當然有的不適合 的怎樣做也不行。

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